Исследование возможности применения метода УФ-спектрофотометрии в анализе нового соединения с антигипоксической активностью

Авторы

Автор для корреспонденции

Финансирование

Конфликт интересов

Аннотация

Ключевые слова

Для цитирования

DOI

Введение

Вопрос обеспечения населения эффективными и безопасными лекарственными препаратами всегда являлся одним из приоритетных. Особую актуальность данная проблема приобрела в связи с утверждением Стратегии развития фармацевтической промышленности на период до 2030 года Распоряжением Правительства Российской Федерации от 7 июня 2023 г №1495 и сложившейся внешнеполитической ситуацией. Группой исследователей под руководством профессора И.А. Волчегорского в Южно-Уральском государственном медицинском университете синтезировано новое вещество, обладающее антигипоксической активностью [1]. Данное соединение, получившее название «Тиоксипин» (патент РФ № 2797949 от 13.06.2023) [2], представляет собой сложный эфир 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина (ЭМГП) и тиоктовой кислоты (ТОК), структурная, брутто-формула и молекулярная масса «Тиоксипина» приведены на рисунке 1.

Рис. 1. Структурная, брутто-формула и молекулярная масса 2-этил-6-метилпиридинол-3-ил-тиооктаноата (Тиоксипина).

C₁₆H₂₃NS₂O_2, M=325,34 а.е.м.

Наряду с фармакологическими исследованиями одним из этапов пути «новая молекула» – «лекарственное средство» является этап разработки стандартных методик определения качества лекарственного препарата, критериев подлинности, определение устойчивости при хранении в разных условиях самой лекарственной субстанции и лекарственных форм на её основе.

Цель исследования

Целью данной работы является исследование возможности использования метода спектрофотометрии в ультрафиолетовой области в анализе Тиоксипина и разработка методик для оценки его количественного содержания и стабильности при хранении.

Материалы и методы исследования

Объект исследования представляет собой маслянистую жидкость интенсивного желтого цвета; нерастворим в воде, постепенно гидролизуется в растворах с нейтральной, кислой или щелочной средой; хорошо растворим в этиловом спирте, изопропиловом спирте, диметилсульфоксиде, хлороформе, в разбавленных растворах сильных кислот.

Для данного исследования был взят образец субстанции Тиоксипина, синтезированный в 2024 году, очищенный двукратной экстракцией кипящим н-гексаном категории осч. (сорт 1, «Криохром» ТУ 2631-001-54260861-2013) и в последующем выдержанный в вакууме при давлении не более 15 мм Hg ст. до постоянной массы. В качестве растворителя использовался этиловый спирт 95% (ЛП-003096 ООО «Гиппократ» г. Самара).

Взвешивание проб проводились на аналитических весах OHAUS EX224/AD (США).

Измерения проводились на спектрофотометре СФ-56 («ЛОМОСПЕКТР», Россия), снабжённом кварцевыми кюветами с длиной оптического пути 1,00 см, в условиях комнатной температуры. В качестве раствора сравнения использовался чистый растворитель. На всех этапах исследования применяли мерную посуду, соответствующую первому классу точности.

Результаты и их обсуждение

В ранее проведенных исследованиях были изучены основные спектрофотометрические характеристики Тиоксипина и исходных компонентов, составляющих его структуру, в УФ-области спектра [1]. Так, в этиловом спирте 95% Тиоксипин имеет выраженный максимум поглощения при длине волны 269±2 нм, что обусловлено наличием пиридинового ядра в его структуре, и маловыраженный максимум при 332±2 нм, что соответствует поглощению дисульфидной связи остатка тиоктовой кислоты. Максимумы поглощения ЭМГП в этиловом спирте 95% составляет 287±2 нм, а ТОК – 332±2 нм.

Спектрофотометрическое определение количественного содержания ТОП проводилось в двух вариантах. Первый вариант имеет традиционное исполнение, включающее приготовление стандартных калибровочных растворов ТОП с известной концентрацией и измерение их оптической плотности при длине волны, соответствующей максимуму поглощения – 269 нм. Калибровочный график, построенный в диапазоне концентраций 0 – 200 мМ ТОП представлен на рисунке 2.

Рис. 2. График зависимости оптической плотности от концентрации раствора ТОП.

Полученные данные позволяют сделать вывод о соблюдении линейности в выбранном диапазоне концентраций Тиоксипина, коэффициент корреляции составил 0,9999. Также рассчитан молярный коэффициент поглощения, который составил 4,6×10³ л моль^-1см^-1.

При этом установлено, что в широком диапазоне концентраций спиртовых растворов Тиоксипина от 0 мкM до 200 мкM (0 % – 0,00640 %) максимумы поглощения спиртовых растворов ТОК не подвержены сдвигу ни в коротковолновую, ни в длинноволновую область, что продемонстрировано на рисунке 3.

Риc. 3. Спектры поглощения спиртовых растворов ТОП в УФ-области.

Для оценки открываемости методики спектрофотометрического определения использовали следующее: точную навеску Тиоксипина массой порядка 100-150 мг помещали в мерную колбу объёмом 50,0 мл, растворяли в 10-15 мл этилового спирта 95% и доводили до метки тем же растворителем. Затем 1,00 мл аликвотной части переносили в мерные колбы вместимостью 50,0 мл и также доводили до метки тем же растворителем. Измерение оптической плотности 6 полученных образцов проводили в кварцевых кюветах 1,00 см против этилового спирта 95%. Полученные результаты приведены в табл. 1.

Таблица 1. Результаты оценки открываемости методики

Тем самым установлено, что при использовании данной методики спектрофотометрического определения, открываемость ТОП не выходит за пределы 98,14 – 101,41 %. Относительное стандартное отклонение среднего результата оказалось равным 1,41%, что свидетельствует о сходимости результатов определения. Вероятность ошибочного результата p<0,05, что указывает на отсутствие значимой систематической ошибки определения.

Данный вариант спектрофотометрического определения ТОП может быть использован для определения его содержания в образцах субстанции и для оценки его содержания в лекарственных формах в присутствии вспомогательных компонентов.

Второй вариант спектрофотометрического определения Тиоксипина, с использованием дифференциальной составляющей, использован нами для определения содержания этого соединения в образцах субстанций, находившихся в режиме хранения. Метод дифференциальной СФ-УФ активно используется исследователями в фармацевтическом анализе биологически активных веществ, содержащих различные примеси [3].

ТОП является сложным эфиром алифатической кислоты – ТОК и ароматического гидроксильного соединения – ЭМГП (рис.1). Известно, что такие соединения достаточно легко поддаются гидролизу, что и было установлено в отношении ТОП ранее [1]. Вполне обосновано ожидать, что при хранении данного соединения, при дозировании, при упаковке лекарственных форм на основе данного соединения, неизбежно попадание следов влаги. Это может привести к появлению в образцах ТОП незначительных эквимолярных количеств продуктов его гидролиза – ТОК и ЭМГП. Присутствие этих соединений в образцах ТОП может служить показателем сохранности данного вещества при хранении.

В связи с тем, что максимумы поглощения в ближней УФ области ТОП (332±2 нм) и продукта его гидролиза ТОК (332±2 нм) совпадают, применение метода прямого спектофотометрического определения ТОП в присутствии ТОК и ЭМГП даст неизбежные значительные ошибки. Поэтому для оценки качества исследуемой субстанции был опробован метод дифференциальной спектрофотометрии, осуществляемый путём измерения оптической плотности спиртовых растворов образцов ТОП в дальней УФ области при двух значениях длин волн, а именно при 269 нм и 287 нм. Эти значения являются оптимальными в случае образования эквимолекулярных количеств ТОК и ЭМГП при частичном гидролизе исследуемого вещества, так как максимум поглощения ЭМГП соответствует 287 нм. Для чистого образца, не загрязнённого примесями ТОК и ЭМГП, величина ∆D=D₂₆₉ – D₂₈₇ также, как и сама величина оптической плотности при данной длине волны, зависит только от оптических свойств самого соединения и растворителя, в котором находится вещество, а также линейно зависит от молярной концентрации в достаточно широких пределах.

Определение проводили по следующей схеме: навеску исследуемого образца ТОП массой 0,10±0,01 г (точная навеска) помещали в мерную колбу объёмом 50,0 мл, растворяли в 20-40 мл 95% этанола и доводили до метки тем же растворителем (раствор А). Затем аликвотную часть раствора А (не менее пяти параллелей) объёмом 2,0 мл переносили в мерные колбы 50,0 мл и также доводили до метки (фотометрируемые растворы). Измерение оптической плотности осуществляли при длинах волн 269 нм и 287 нм против чистого растворителя. По данным измерения находили величину ∆D=D₂₆₉ – D₂₈₇, которую использовали для расчета содержания ТОП в образце по калибровочному графику.

Калибровочный график (рис. 4) строили, исходя из значений величин ∆D=D₂₆₉ – D₂₈₇, растворов, моделирующих присутствие продуктов гидролиза ТОП с различной степенью глубины протекания этого процесса. Для этого брали такие точные навески ТОП и продуктов гидролиза – ТОК и ЭМГП, чтобы получились растворы с равными молярными концентрациями.

Рис. 4. График зависимости разности оптических плотностей (∆D = D₂₆₉ – D₂₈₇) от мольной доли W ТОП в образцах подверженных частичному гидролизу.

Брали точные навески ТОП и продуктов гидролиза – ТОК и ЭМГП, таким образом, чтобы получились растворы с равными молярными концентрациями. В приводимом здесь примере из навески m_ТОП=0,0956 г был приготовлен раствор в 95% этаноле объёмом 50,00 мл, что составило величину молярной концентрации – 5,877 мМ. Массы точных навесок ТОК и ЭМГП для приготовления растворов с такой же молярной концентрацией рассчитывали, исходя из m_ТОП, учитывая соотношение их молярных масс и молярной массы ТОП, соответственно:

Далее из полученных растворов ПОП, ТОК и ЭМГП готовили разбавленные растворы путём 25-ти кратного разбавления этанолом. Молярные концентрации при этом составили величину – 235,0 мкМ. Эти растворы использовали для приготовления модельных, имитирующих частично гидролизованные образцы ТОП. Всего было приготовлено 6 модельных растворов в пяти параллельных смешиваниях, в которых мольная доля ТОП постепенно снижается от 1,0 до 0,88 и стехиометрически увеличивается содержание продуктов его гидролиза – ЭМГП и ТОК (табл. 2).

Таблица 2. Состав модельных растворов, имитирующих степень гидролитической деструкции ТОП

Результаты модельных исследований процесса гидролитической деструкции соединения ТОП, полученные методом дифференциальной спектрофотометрии, показали высокую степень линейности зависимости величины ∆D=D₂₆₉ – D₂₈₇ от мольной доли W ТОП. Коэффициент корреляции r составил 0,9966, при высоком значении достоверности полученных результатов p<0,05, что соответствует требованиям, предъявляемым к методикам количественного анализа.

Для оценки открываемости второго варианта методики определения ТОП в спиртовых растворах, реализующий производный тип метода дифференциальной спектрофотометрии, был построен калибровочный график зависимости разности оптической плотности спиртовых растворов ТОП при длинах волн 269 нм и 287 нм относительно растворителя от его молярной концентрации. Измерение оптической плотности проводили в кварцевых кюветах 1,00 см. В диапазоне концентраций от 0 до 300 мкM наблюдается линейная зависимость ∆D=D₂₆₉ – D₂₈₇ от концентрации ТОП, коэффициент корреляции равен 0,9997 (рис. 5).

Аналогично первому варианту СФ-определения была взята серия навесок данного соединения, приготовлены его растворы и в пяти параллелях найдены экспериментальные значения масс ТОП, исходя из приведённого калибровочного графика (рис. 5).

Рис. 5. График зависимости разности оптических плотностей (∆D = D₂₆₉ – D₂₈₇) от концентрации ТОП.

Результаты оценки открываемости методики дифференциальной СФ определения ТОП приведены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты оценки открываемости методики дифференциальной СФ количественного определения

Таким образом показано, что при использовании дифференциальной методики спектрофотометрического определения, открываемость ТОП не выходит за пределы 100,8 – 101,4 %.  Истинное значение открываемости – 100% оказалось незначительно ниже нижнего значения доверительного интервала средних результатов анализа. Вместе с тем максимальное значение относительной ошибки в серии определений в этом варианте определения – 1,45%, то есть меньше, чем значения этой величины при использовании первого варианта методики – 2,02%, что сопоставимо с номинированной величиной относительной ошибки взвешивания аналитических весов ∆m= 0, 0002 г., которые использовались для взятия навесок исследуемого соединения. Относительная ошибка взвешивания для этой марки весов в диапазоне масс 0,0100 – 0,2000 г составляет до 2%. При минимальном значении массы навески в эксперименте эта величина составляет 0,5%.

На основании проведенных исследований особенностей спектральных свойств сложного эфира 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина и тиоктовой кислоты (Тиоксипина) показана возможность применения данного метода для его количественного определения в ультрафиолетовой области спектра.

Выводы

Предложены два варианта методики количественного определения Тиоксипина. Результаты исследования позволяют сделать вывод о применении метода УФ-спектрофотометрии в классическом и дифференциальном вариантах для определения количественного содержания в субстанции, а также для определения устойчивости при хранении Тиоксипина.

Список литературы

Evaluation of UV Spectrophotometry for the Analysis of a Novel Antihypoxic Compound

Authors

Corresponding Author

Conflict of interest

Funding

Abstract

Key words

DOI

References