Журнал МЕДИЦИНА

Фармакофорный анализ структуры нового 1,3,4-тиадиазолиламидного производного вальпроевой кислоты

Малыгин А. С.
аспирант, кафедра фармакологии и клинической фармакологии1
Яснецов В. В.
д.м.н., ведущий научный сотрудник, лаборатория экспериментальной и клинической фармакологии2

1ФГБОУ ВО Тверской государственный медицинский университет Минздрава России
2ФБУН Государственный научный центр Российской Федерации – Институт медико-биологических проблем Российской академии наук

Автор для корреспонденции: Малыгин Александр Сергеевич; e-mail: dr.a.s.m@yandex.ru. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Проведен фармакофорный анализ структуры вальпразоламида – 1,3,4-тиадиазолиламидного производного вальпроевой кислоты. Показано, что новый вальпроат содержит замещенную амидную группу, гидрофобный и электронодонорный домены – фармакофоры, которые определяют его противоэпилептическую активность. Вальпроевая кислота имеет только гидрофобный фрагмент. Модификация вальпроевой кислоты путем введения в ее структуру дополнительного фармакофора – 1,3,4-тиадиазола приводит к снижению токсичности и повышению противоэпилептической активности.

фармакофорный анализ, вальпроевая кислота, 1,3,4-тиадиазол, противоэпилептическая активность

Для цитирования: Малыгин А. С., Яснецов В. В. Фармакофорный анализ структуры нового 1,3,4-тиадиазолиламидного производного вальпроевой кислоты. Медицина 2020; 8(3): 58-66.

Введение

Проведение фармакофорного анализа биологически активных веществ и моделирование новых молекул на основе фармакофоров является перспективным направлением в повышении эффективности лекарственных средств различных фармакологических групп, в том числе с противоэпилептической активностью. Актуальность разработки новых антиконвульсантов связана с высокой частотой фармакорезистентности [1] и недостаточной безопасностью имеющихся препаратов [2]. В настоящее время известны различные фармакофоры, которые участвуют в реализации противосудорожных свойств лекарственных средств. В исследовании [3] показано, что простейшим фармакофором, определяющим противоэпилептическую активность, является α-замещенная амидная группа. S.N. Pandeya [4] предложил фармакофорную модель, в которой для противоэпилептических средств значимыми являются следующие фармакофоры: электронодонорный домен, гидрофобный арильный или иной дистальный гидрофобный радикал, водородные связи. Фармакофорный подход был успешно использован для поиска соединений с противоэпилептическими свойствами [5].

Антиконвульсантом наиболее простого строения является вальпроевая кислота, которая представляет собой жирную кислоту с химической структурой – 2-пропилпентановая кислота. Преимуществом вальпроевой кислоты является ее эффективность при эпилепсии различных форм, а также широкий спектр фармакологической активности, в том числе противоопухолевое, обезболивающее, антиретровирусное, нейропротекторное действие и др. [6-7]. В связи с этим целесообразным представляется модификация химической структуры вальпроевой кислоты путем введения дополнительных фармакофоров.

Новым 1,3,4-тиадиазолиамидным производным вальпроевой кислоты является N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпентанамид, синтезированный в АО "ВНЦ БАВ" (Московская область, Старая Купавна) [8]. Экспериментально было показано наличие у нового вальпроата противоэпилептической активности [9-10] и низкой токсичности [11]. Для оценки полученных результатов и определения направлений дальнейшего поиска эффективных противоэпилептических средств целесообразным является проведение фармакофорного анализа структуры данного вальпроата.

Цель исследования

Цель исследования – провести сравнительный фармакофорный анализ структуры вальпроевой кислоты и ее нового 1,3,4-тиадиазолиамидного производного.

Материалы и методы исследования

В работе исследовали N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпeнтанaмид – новое 1,3,4-тиадиазолиламидное производное вальпроевой кислоты с лабораторным наименованием вальпразоламид. Химическую структуру нового вальпроата устанавливали спектроскопическими методами (ИК-, ЯМР-, масс-спектрометрии) [9]. ИК-спектр (ν/см^-1) вальпразоламида: 3302, 3030 (NH), 2981, 2959, 2860 (СН), 1545 (NHCO). ЯМР-спектр: ¹H-ЯМР (400 MГц, DMSO-d6) δ ppm: 0,97 (s, 3H, CH3), 1,33 (s, 2H, CH2), 1,41–1,50 (m, 4H), 2,65 (s, 2H, CH2), 10,63 (s, 1H, NH); ¹³C-ЯМР (400 MГц, DMSO-d6) δ ppm: 13,48, 13,66, 20,06, 24,70, 35,27, 43,22, 155,85, 156,5, 175,00. Масс-спектр (с использованием электроспрей ионизации – ESI): ESI⁺ – m/z 256,1 ([M + H]⁺); ESI^– – m/z 254,0 ([M – H] ^–).

Оценку фармакологической активности и токсичности вальпразоламида проводили в экспериментах на аутбредных мышах SNK обоего пола массой 19-21 г. Содержание подопытных животных и обращение с ними во время экспериментов соответствовали всем установленным требованиям [12-13]. В качестве референтного препарата применяли вальпроевую кислоту. Значение LD₅₀ (полулетальной дозы) вальпразоламида и вальпроевой кислоты определяли методом пробит-анализа. Нейротоксичность антиконвульсантов оценивали в тесте вращающегося стержня (rotarod test) [14]. Моделирование эпилепсии осуществляли с использованием отечественных [14] и зарубежных [15] рекомендаций. Оценку противоэпилептической активности проводили на моделях максимального электрошока, антагонизма с пентилентетразолом, изониазидом, тиосемикарбазидом, пилокарпином и камфорой. Определяли значения ЕD₅₀(средней терапевтической дозы), терапевтического (TI – отношение полулетальной дозы к средней терапевтической) и протективного (РI – отношение средней токсической дозы к средней терапевтической) индексов.

Для статистического анализа использовали "BioStat, 2009" (AnalystSoft; США). Для оценки типа распределения данных применяли W-критерий Шапиро-Уилка. При нормальном распределении данных использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), при отсутствии нормального распределения – критерий Краскела-Уоллиса и U-тест Манна-Уитни. Расчет доз осуществляли методом пробит-анализа Финни с указанием 95% доверительного интервала.

Результаты исследования и их обсуждение

Вальпроевая (2-пропилпентановая) кислота – это короткоцепочечная насыщенная жирная кислота с разветвленной цепью, которая очень мало растворима в воде. Основным фармакофором, определяющим противоэпилептическую активность вальпроевой кислоты, является гидрофобный фрагмент, представляющий собой разветвленную углеводородную цепь (рис.1).

Рис. 1. Фармакофорный анализ структуры вальпроевой кислоты.

1 – гидрофобный фрагмент (разветвленный углеводородный радикал)

Вальпразоламид (N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпeнтанaмид) был получен путем модификации молекулы вальпроевой кислоты за счет введения дополнительных фармакофоров: замещенной амидной группы и электронодонорного домена (1,3,4-тиадиазола) (рис. 2).

Рис. 2. Фармакофорный анализ структуры вальпразоламида.

1 – электронодонорный домен; 2 – замещенная амидная группа; 3 – гидрофобный фрагмент

По результатам пробит-анализа величина полулетальной дозы (LD₅₀) вальпразоламида при внутрибрюшинном введении мышам составила 924,8 (756,9 ÷ 1063,7) мг/кг, что было в среднем в 1,8 раза (р<0,05) выше, чем у вальпроевой кислоты – 512,9 (399,0÷611,7) мг/кг. Полученные данные свидетельствуют о меньшей острой токсичности модифицированного вальпроата.

Наличие противоэпилептической активности у вальпразоламида было показано в экспериментах на мышах при судорогах, индуцированных максимальным электрошоком (МЭШ) и в тестах антагонизма с конвульсантами, имеющими различные механизмы действия (табл. 1).

Таблица 1. Механизм действия конвульсантов и эффективность вальпразоламида при судорогах, индуцированных химическими агентами

Конвульсант	Механизм действия конвульсанта	Эффективность вальпразоламида
Пентилентетразол (95 мг/кг, подкожно)	Антагонист ГАМК_А-рецепторов	Уменьшение летальности Удлинение латентного периода судорог
Изониазид (250 мг/кг внутрибрюшинно)	Ингибитор синтеза ГАМК (ингибитор глутаматдекарбоксилазы)	Уменьшение летальности Удлинение латентного периода судорог
Тиосемикарбазид (30 мг/кг внутрибрюшинно)	Ингибитор синтеза ГАМК (ингибитор глутаматдекарбоксилазы)	Уменьшение летальности Удлинение латентного периода судорог
Пилокарпин (350 мг/кг внутрибрюшинно)	М-холиномиметик	Удлинение латентного периода судорог (миоклонус головы)
Камфора (1000 мг/кг, внутрибрюшинно)	Аналептик, нарушение обмена моноаминов в ЦНС	Удлинение латентного периода судорог

Наибольшую противоэпилептическую активность новый вальпроат проявлял при судорогах, индуцированных максимальным электрошоком, а также средствами, уменьшающими содержание ГАМК в головном мозге – антагонистом ГАМК_А-рецепторов пентилентетразолом и ингибитором синтеза ГАМК изониазидом. Для данных моделей эпилепсии значения ED₅₀ вальпразоламида (внутрибрюшинно, мыши) составили соответственно 138,4 (97,2÷197,2) мг/кг, 74,5 (46,8÷106,4) мг/кг и 126,8 (65,5÷245,4) мг/кг. При тиосемикарбазид-индуцированных судорогах у мышей новый вальпроат в дозе 150 мг/кг уменьшал летальность подопытных мышей на 37,5% по сравнению с контролем, что было сопоставимо с эффектами вальпроевой кислоты в дозе 200 мг/кг. При судорогах, индуцированных МЭШ и подкожным введением пентилентетразола значения терапевтического и протективного индексов вальпразоламида статистически значимо превышали аналогичные у вальпроевой кислоты (табл. 2).

Таблица 2. Противоэпилептическая активность вальпроевой кислоты и вальпразоламида при судорогах, индуцированных максимальным электрошоком и пентилентетразолом при подкожном введении у мышей

Серия опытов	МЭШ ED₅₀, мг/кг	МЭШ ТИ	МЭШ ПИ	ПТЗ ED₅₀, мг/кг	ПТЗ ТИ	ПТЗ ПИ
ВК	234,0 (181,4÷278,1)	2,2	1,7	179,3 (137,8÷326,0)	2,9	2,1
ВПЗ	138,4 (97,2÷197,2)	6,7	3,3	74,5 (46,8÷106,4)	12,4	6,1

Примечание: МЭШ – максимальный электрошок, ПТЗ – пентилентетразол, ED₅₀– средняя терапевтическая доза, ТИ – терапевтический индекс, ПИ – протективный индекс, ВК – вальпроевая кислота, ВПЗ – вальпразоламид.

В тестах антагонизма с пилокарпином и камфорой вальпразоламид статистически значимо удлинял латентный период первого судорожного приступа, однако не влиял на выживаемость подопытных животных.

Таким образом, сравнительный анализ фармакологической активности вальпразоламида и вальпроевой кислоты показал, что новый вальпроат обладал более выраженными противоэпилептическими свойствами и меньшей острой токсичностью по сравнению с референтным препаратом. Полученные данные согласуются с результатами других исследователей, изучавших модифицированные формы вальпроевой кислоты и 1,3,4-тиадиазолы с противоэпилептической активностью.

Наиболее простым по химическому строению модифицированным вальпроатом является вальпромид (2-пропилпeнтанaмид), представляющий собой амидированную форму вальпроевой кислоты. В тестах максимального электрошока и антагонизма с пентилентетразолом у мышей вальпромид был в среднем в 2-5 раз эффективнее вальпроевой кислоты, однако имел более выраженные седативные свойства и большую токсичность [16]. В исследованиях [17-18] показано, что амидирование карбоксильной группы вальпроевой кислоты приводило к снижению тератогенных свойств, что важно для клинической практики, так как одним из наиболее значимых побочных эффектов вальпроевой кислоты является ее тератогенность.

Наряду с замещенной амидной группой в структуре нового вальпроата имеется электронодонорный домен 1,3,4-тиадиазола. Среди производных 1,3,4-тиадиазола выявлено большое число соединений с выраженными противоэпилептическими свойствами [19-20]. Показано, что введение фрагмента 1,3,4-тиадиазола в структуру известного антиконвульсанта фенитоина приводило к повышению его противоэпилептической активности [21]. Известно, что многие 1,3,4-тиадиазоловые производные обладают меньшей токсичностью по сравнению с исходными веществами [22-23]. Приведенные данные показывают актуальность использования фармакофорного подхода к созданию новых противоэпилептических средств.

Выводы

1. Установлены фармакофоры, определяющие фармакологические свойства вальпроевой кислоты и вальпразоламида – ее нового 1,3,4-тиадиазолиламидного производного: они содержат в своей структуре гиброфобный домен (дистальный углеводородный радикал), с которым связано их противоэпилептическое действие.

2. Модификация вальпроевой кислоты путем введения дополнительных фармакофоров – замещенной амидной группы и электронодонорного фрагмента (1,3,4-тиадиазола) – привела к снижению острой токсичности и повышению противоэпилептической активности нового вальпроата.

1. Kalilani L., Sun Х, Pelgrims В. et al. The epidemiology of drug-resistant epilepsy: A systematic review and meta-analysis. Epilepsia 2018; 59 (12): 2179-2193.

2. Авакян Г.Н., Белоусова Е.Д., Бурд С.Г. и др. Проблемы эпилептологии. Ключевые приоритеты, задачи, вызовы и способы их решения. Эпилепсия и пароксизмальные состояния 2019; 11 (4): 395-406.

3. Krivoshein A.V. Antiepileptic Drugs Based on the α-Substituted Amide Group Pharmacophore: From Chemical Crystallography to Molecular Pharmaceutics. Curr Pharm Des. 2016; 22 (32): 5029-5040.

4. Pandeya S.N., Raja A.S., Stables J.P. Synthesis of isatin semicarbazones as novel anticonvulsants – role of hydrogen bonding. J Pharm Pharm Sci. 2002; 5 (3): 266-271.

5. Khan H.N., Kulsoom S., Rashid H. Ligand based pharmacophore model development for the identification of novel antiepileptic compound. Epilepsy Res. 2012; 98 (1): 62-71.

6. Tomson T., Battino D., Perucca E. The remarkable story of valproic acid. Lancet Neurol. 2016; 15(2): 141.

7. Perucca E. Pharmacological and therapeutical properties of valproate: a summary after 35 years of clinical experience. CNS Drugs 2012; 16 (10): 695-714.

8. Пат. 2651572 Российская Федерация, МПК А 61 К 31/433 N-(5-Этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпентанамид, обладающий противоэпилептической и обезболивающей активностями. С.Я. Скачилова, А.С. Малыгин, Н.С. Попов [и др.]; заявитель и патентообладатель ОАО ВНЦ БАВ. – № 267288; заявл. 13.03.2018; опубл. 20.11.2018, Бюл. № 32. 8 с.

9. Malygin A.S., Demidova M.A., Skachilova S.Ya., Shilova E.V. Synthesis of a novel amide derivative of valproic acid and 1,3,4-thiadiazole with antiepileptic activity. Bulletin of RSMU. 2020; 1: 75-80.

10. Малыгин А.С. Исследование противоэпилептической активности нового амидного производного вальпроевой кислоты и 1,3,4-тиадиазола. Эпилепсия и пароксизмальные состояния 2019; 4: 357-363.

11. Малыгин А.С. Оценка острой токсичности и нейротоксичности нового амидного производного вальпроевой кислоты и 1,3,4-тиадиазола. Медицина 2019; 3: 37-46.

12. Приказ МЗ РФ от 01.04.2016 № 199н "Правила надлежащей лабораторной практики".

13. Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Directive 2010/63/EU).

14. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К., 2012. 944 с.

15. Kandratavicius L., Balista P., Lopes-Aguiar C. et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 2014; 10: 1693-1705.

16. Löscher W., Nau H. Pharmacological evaluation of various metabolites and analogues of valproic acid: anticonvulsant and toxic potencies in mice. Neuropharmacology 1985; 24(5): 427-435.

17. Okada A., Kurihara H., Aoki Y. et al. Amidic modification of valproic acid reduces skeletal teratogenicity in mice. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. 2004; 71(1): 47-53.

18. Radatz M., Ehlers K., Yagen B. et al. Valnoctamide, valpromide and valnoctic acid are much less teratogenic in mice than valproic acid. Epilepsy Res. 1998; 30(1):41-48.

19. Raj V., Rai A., Singh M. Recent Update on 1,3,4-Thiadiazole Derivatives: As Anticonvulsant Agents. American Research Journal of Pharmacy 2015; 1(1): doi: 10.21694/2380-5706.15005

20. Luszczki J.J., Kaspinska M., Matysiak J., Niewiadomy A. Characterization and preliminary anticonvulsant assessment of some 1,3,4-thiadiazole derivatives. Pharmacol Rep. 2015; 67(3): 588-592.

21. Botros S., Khalil N.A., Naguib B.H., El-Dash Y. Synthesis and anticonvulsant activity of new phenytoin. Eur J Med Chem. 2013; 60: 57-63.

22. Matysiak J. Biological and pharmacological activities of 1,3,4-thiadiazole based compounds. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 2015; 15 (9): 762-775.

23. Popov N., Demidova M., Malygin A. Assessment of pharmacological activity and bioavailability of the new derivative 1,3,4-thiadiazole. Research Results in Pharmacology 2018; 4(2): 27-46.

Pharmacophoric Analysis of the Structure of a New 1,3,4-Thiadiazolylamide Derivative of Valproic Acid

Malygin A. S.
Post-graduate student, Chair for Pharmacology and Clinical Pharmacology1
Yasnetsov V. V.
Doctor of Medicine, Leading Researcher, Chair for Experimental and Clinical Pharmacology2

1Tver State Medical University, Tver, Russia 2State Scientific Center of the Russian Federation – Institute of Medical and Biological Problems of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia

Corresponding author: Malygin A.S.; e-mail: dr.a.s.m@yandex.ru. Conflict of interest: None declared. Funding: The study had no sponsorship.

Pharmacophoric analysis of the structure of valprazolamide, a 1,3,4-thiadiazolylamide derivative of valproic acid, was carried out. It was shown that the new valproate contains a substituted amide group, hydrophobic and electron-donor domеns – pharmacophores, determining its antiepileptic activity. Valproic acid has only a hydrophobic moiety. Modification of valproic acid by introducing an additional pharmacophore, 1,3,4-thiadiazole, into its structure leads to a decrease in toxicity and an increase in antiepileptic activity.

pharmacophoric analysis, valproic acid, 1,3,4-thiadiazole, antiepileptic activity

1. Kalilani L., Sun Х, Pelgrims В. et al. The epidemiology of drug-resistant epilepsy: A systematic review and meta-analysis. Epilepsia 2018; 59(12): 2179-2193.

2. Avakyan G.N., Belousova E.D., Burd S.G. et al. Problemy epileptologii. Klyuchevye prioritety, zadachi, vyzovy i sposoby ih resheniya. [Problems of epileptology. Key priorities, tasks, challenges and ways to address them.] Epilepsiya i paroksizmal'nye sostoyaniya [Epilepsy and paroxysmal conditions] 2019; 11 (4): 395-406. (In Russ.)

3. Krivoshein A.V. Antiepileptic Drugs Based on the α-Substituted Amide Group Pharmacophore: From Chemical Crystallography to Molecular Pharmaceutics. Curr Pharm Des. 2016; 22(32): 5029-5040.

4. Pandeya S.N., Raja A.S., Stables J.P. Synthesis of isatin semicarbazones as novel anticonvulsants – role of hydrogen bonding. J Pharm Pharm Sci. 2002; 5(3): 266-271.

5. Khan H.N., Kulsoom S., Rashid H. Ligand based pharmacophore model development for the identification of novel antiepileptic compound. Epilepsy Res. 2012; 98(1): 62-71.

6. Tomson T., Battino D., Perucca E. The remarkable story of valproic acid. Lancet Neurol. 2016; 15(2): 141.

7. Perucca E. Pharmacological and therapeutical properties of valproate: a summary after 35 years of clinical experience. CNS Drugs 2012; 16(10): 695-714.

8. Pat. 2651572 Rossijskaya Federaciya, MPK A 61 K 31/433 N-(5-Etil-1,3,4-tiadiazol-2-il)-2-propilpentanamid, obladayushchij protivoepilepticheskoj i obezbolivayushchej aktivnostyami. S.Ya. Skachilova, A.S. Malygin, N.S. Popov i dr.; zayavitel' i patentoobladatel' OAO VNC BAV. [Pat. 2651572 Russian Federation, IPC A 61 K 31/433 N- (5-Ethyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)-2-propylpentanamide, possessing antiepileptic and analgesic activities S.Ya. Skachilova, A.S. Malygin, N.S. Popov et al.; applicant and patentee of OJSC VNTs BAV.] № 267288; declared 03.13.2018; publ. 20.11.2018, Bul. 32. (In Russ.)

10. Malygin A.S. Issledovanie protivoepilepticheskoj aktivnosti novogo amidnogo proizvodnogo val'proevoj kisloty i 1,3,4-tiadiazola. [Investigation of antiepileptic activity of a new amide derivative of valproic acid and 1,3,4-thiadiazole.] Epilepsiya i paroksizmal'nye sostoyaniya [Epilepsy and paroxysmal conditions] 2019; 4: 357-363. (In Russ.)

11. Malygin A.S. Ocenka ostroj toksichnosti i nejrotoksichnosti novogo amidnogo proizvodnogo val'proevoj kisloty i 1,3,4-tiadiazola. [Evaluation of acute toxicity and neurotoxicity of a new amide derivative of valproic acid and 1,3,4-thiadiazole.] Medicine 2019; 3: 37-46. (In Russ.)

12. Prikaz MZ RF ot 01.04.2016 № 199n "Pravila nadlezhashchej laboratornoj praktiki" [Order of the Ministry of Health of the Russian Federation dated 01.04.2016 №199n "Rules of Good Laboratory Practice"]. (In Russ.)

13. Evropejskaya konvenciya o zashchite pozvonochnyh zhivotnyh, ispol'zuemyh dlya eksperimentov ili v inyh nauchnyh celyah (Directive 2010/63/EU). [European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental or Other Scientific Purposes (Directive 2010/63/EU)]. (In Russ.)

14. Mironov A.N. Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskih issledovanij lekarstvennyh sredstv. [Guidelines for conducting preclinical studies of drugs.] Moscow: Grif i K., 2012. (In Russ.)

15. Kandratavicius L., Balista P., Lopes-Aguiar C. et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 2014; 10: 1693-1705.

16. Löscher W., Nau H. Pharmacological evaluation of various metabolites and analogues of valproic acid: anticonvulsant and toxic potencies in mice. Neuropharmacology 1985; 24(5): 427-435.

17. Okada A., Kurihara H., Aoki Y. et al. Amidic modification of valproic acid reduces skeletal teratogenicity in mice. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. 2004; 71(1): 47-53.

18. Radatz M., Ehlers K., Yagen B. et al. Valnoctamide, valpromide and valnoctic acid are much less teratogenic in mice than valproic acid. Epilepsy Res. 1998; 30(1):41-48.

19. Raj V., Rai A., Singh M. Recent Update on 1,3,4-Thiadiazole Derivatives: As Anticonvulsant Agents. American Research Journal of Pharmacy 2015; 1(1): doi: 10.21694/2380-5706.15005

20. Luszczki J.J., Kaspinska M., Matysiak J., Niewiadomy A. Characterization and preliminary anticonvulsant assessment of some 1,3,4-thiadiazole derivatives. Pharmacol Rep. 2015; 67(3): 588-592.

21. Botros S., Khalil N.A., Naguib B.H., El-Dash Y. Synthesis and anticonvulsant activity of new phenytoin. Eur J Med Chem. 2013; 60: 57-63.

22. Matysiak J. Biological and pharmacological activities of 1,3,4-thiadiazole based compounds. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 2015; 15(9): 762-775.

23. Popov N., Demidova M., Malygin A. Assessment of pharmacological activity and bioavailability of the new derivative 1,3,4-thiadiazole. Research Results in Pharmacology 2018; 4(2): 27-46.