Введение

Многие синтетические каннабимиметики, синтезированные в научных целях при поиске новых лекарственных средств, стали предметом неправомерного использования в качестве наркотических средств, способствуя, таким образом, расширению номенклатуры нелегальных веществ на рынке незаконного оборота наркотиков.

В ноябре 2016 года в Бельгии с использованием различных аналитических прикладных методов был идентифицирован новый каннабимиметик 5F-MDMB-PICA (MDMB-2201) в образцах порошка и "спайсов", поступивших в лабораторию на токсикологическое исследование [8]. С фармакологической точки зрения MDMB-2201 является мощным высокоэффективным агонистом каннабиноидных рецепторов (CB1 EC50 = 0.45 нМ; CB2 EC50 = 7.4 нМ) с преимущественной активацией рецепторов 1-го типа [4].

В работе Mogler с соавторами [7] представлены результаты исследования метаболизма MDMB-2201 in vivo на гепатоцитах печени человека и in vivo в моче потребителей с использованием ЖХ-МС/МС.

Первые случаи выявления потребителей каннабимиметика MDMB-2201 при исследовании мочи на наркотические вещества в Российской Федерации произошли в марте и апреле 2019 года в городах Тюмень, Екатеринбург, Курган.

Каннабимиметик MDMB-2201, как производное метилового эфира 3-метил-2-(1-пентил-1H-индол-3-карбоксамидо) бутановой кислоты, отнесен к I Списку Постановления Правительства РФ № 578 от 23.06.2014 [3]. MDMB-2201 является аналогом известного соединения MDMB(N)-2201 [4-6] и отличается от последнего наличием индольного гетероцикла, вместо индазольного в структуре MDMB(N)-2201. Структурные формулы каннабимиметиков MDMB-2201 и MDMB(N)-2201 представлены на рисунке 1.

Рис. 1. Структурные формулы каннабимиметиков MDMB-2201 и MDMB(N)-2201

Учитывая высокую вероятность географического распространения MDMB-2201 и необходимость его идентификации в биологических объектах с целью установления фактов употребления, изучение метаболического профиля мочи нового каннабимиметика MDMB-2201 является важным для работы экспертных лабораторий.

Целью работы является изучение метаболического профиля каннабимиметика MDMB-2201 в моче для целей скрининга с использованием твердофазной экстракции и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ/МС).

Используемое оборудование, объекты и методы исследования

В исследовании применялись растворители и реактивы чистоты "хч". Образцы мочи до исследования хранились в холодильнике при + 4 ^оС.

Пробоподготовка [1]. Пробоподготовка образцов мочи (с ферментативным гидролизом): к 1 мл мочи добавляли по 50 мкл этанольных растворов внутренних стандартов: гидрохлорид этилморфина (0,02 мг/мл), гексенал (0,2 мг/мл), N-этилбензиламин (0,01 мг/мл). Для одной параллели проб мочи (с ферментативным гидролизом): к пробе мочи добавляли 250 мкл 0,067 М буфера фосфатного (pH 6) и 50 мкл β-глюкуронидазы и выдерживали 2 часа при 45^о С.

В образцы мочи (с гидролизом и без) вносили 2 мл 0,067 М буфера фосфатного (рН 4.8). После центрифугирования при 3000 об / мин (10 минут) супернатант отделяли от осадка.

Сорбент патрона для ТФЭ (смешанная фаза) кондиционировали, пропуская по 2 мл 95% этанола и 0,067 М буфера фосфатного (рН 4.8), пропускали образец (скорость – 1 мл/мин). Для промывки использовали 1 мл 0,067 М буфера фосфатного с рН 4.8, 1 мл 10% этанола. Сушка патрона – под вакуумом (20 минут). Получали два элюата: дважды по 2 мл пропускали элюент гексан – этилацетат (2:1), при этом получали I элюат. Затем при двукратном пропускании через патрон по 2 мл элюента метиленхлорид – 2-пропанол – 25% раствор аммиака (2:1:0.1) получали II элюат. Оба элюата испаряли при 45^о С в токе азота.

Дериватизация [1]. Получение метильных производных. К сухому остатку первого элюата вносили 500 мкл ацетона безводного, 40 мкл метилиодида, 20-25 мг карбоната калия безводного, нагревали в термоблоке 60 минут при 60^о С после герметичного укупоривания. Жидкую фракцию смеси после охлаждения флакона отбирали в чистую виалу, испаряли при 40^о С в токе азота. Сухой остаток реконструировали в 100 мкл этилацетата безводного.

Получение ацетильных производных. К сухому остатку II элюата или I элюата (последний после процедуры метилирования) добавляли 40 мкл пиридина безводного, 60 мкл ангидрида уксусного, замывая стенки виалы; укупоренную виалу на 5 минут помещали в СВЧ-печь с мощностью 560 Вт. После охлаждения флакона избыток реагентов удаляли не выше 40^о С в токе азота. Сухой остаток реконструировали в 100 мкл этилацетата безводного.

Триметилсилилирование. К сухому остатку I или II элюатов вносили 100 мкл BSTFA (с 1% триметилхлорсиланом), перемешивали на микровстряхивателе после герметичной укупорки, выдерживали в термоблоке в течение часа при 80^о С. После охлаждения виалы 2 мкл вводили в испаритель газового хроматографа.

Режим работы ГХ/МС. Поток гелия (газ-носитель) через колонку со скоростью 1,5 мл/мин, испаритель хроматографа работал в режиме split/splitless (при делении потока – 15:1, задержка включения после ввода пробы – 1 мин). Температуры интерфейса детектора и испарителя хроматографа устанавливалась 280 и 250^о С, соответственно. Температура колонки: начальная 70^о С (2 мин), прогрев до 280^о С (скорость программирования – 20 град/мин, 8 мин. – выдержка при конечной температуре). Напряжение на умножителе детектора соответствует показателю автоматической настройки детектора.

Масс-спектры ацетильных и метильных дериватов (при полном сканировании ионов) регистрировали в интервале масс 42-450 Да. Масс-спектры триметилсилильных дериватов (при полном сканировании ионов) регистрировали в интервале масс 43-650 Да.

Идентификация компонентов проб была проведена с применением программ MSD ChemStation E.02.01.1177 (Agilent) и AMDIS.

Долю конъюгирования метаболитов MDMB-2201 для их метиловых эфиров определяли по величине отношения площади пиков иона с величиной m/z: для М 1 и артефакта М8 – 232, M2 и артефакта М9– 230, М3 – 158, М4 – 262, М6 и артефакта М5 – 258, М7.1, М7.2 и М10 – М12 – 188, М13.1 и М13.2 – m/z 248 к площади пика иона m/z 235 для внутреннего стандарта N-метилгексенала в I элюате мочи (с гидролизом и без). Содержание М1 было принято за 100%, расчет значения прочих метаболитов проведен по соотношению площади пиков характеристических ионов со 100% интенсивностью в масс-спектре метаболитов.

Расчет констант (LogP, K_OC) проведен с применением пакета программ ACD/Labs v6.0.

Результаты и обсуждение

Химическое название каннабимиметика MDMB-2201 – 2-[1-(5-фторпентил)-1H-индол-3-карбоксамид]-3,3-диметилбутановой кислоты метиловый эфир; брутто формула: C₂₁H₂₉FN₂O₃; молекулярная масса = 376 г/моль. CAS № 1971007-88-1 Синонимы: 5-fluoro-MDMB-2201, 5-fluoro MDMB-PICA.

Структурные формулы предполагаемых метаболитов MDMB-2201, выявленных в реальных пробах мочи, представлены на рисунке 2.

Структуры метаболитов определяли на основании данных масс-фрагментации пиков на хроматограммах при анализе мочи потребителей наркотических средств с учетом характерных закономерностей. Для установления типа функциональных групп, имеющихся в структуре метаболитов, получали различные производные метаболитов.

На рисунках 3-15 приведены структурные формулы, масс-спектры и аналитические характеристики ряда полученных производных метаболитов MDMB-2201.

Рис. 2. Структурные формулы метаболитов MDMB-2201

Рис. 3. Структура, масс-спектр и аналитические характеристики метилового эфира метаболита М1

Рис. 4. Структура, масс-спектр и аналитические характеристики диметилового эфира метаболита М2

Рис. 5. Структура, масс-спектр и аналитические характеристики диметильного производного М3

Рис. 6. Структура, масс-спектр и аналитические характеристики диметилового эфира метаболита М4

Рис. 7. Структура, масс-спектр и аналитические характеристики артефакта метилового эфира метаболита М5

Рис. 8. Структура, масс-спектр и аналитические характеристики диметилового эфира метаболита М6

Рис. 9. Структура, масс-спектр и аналитические характеристики триметильных производных метаболитов М7.1 и М7.2

Рис. 10. Структура, масс-спектр и аналитические характеристики артефакта метаболита М8

Рис. 11. Структура, масс-спектр и аналитические характеристики артефакта метилового эфира метаболита М9

Рис. 12. Структура, масс-спектр и аналитические характеристики метильного эфира метаболитов М13.1 и М13.2

Рис. 13. Структура, масс-спектр и аналитические характеристики метилового эфира метаболитов М13.1 и М13.2 после ацетилирования

Рис. 14. Структура, масс-спектр и аналитические характеристики триметилсильного эфира метаболита М1

Рис. 15. Структура, масс-спектр и аналитические характеристики бис-триметилсилильного производного М3

При исследовании проб с применением различных видов дериватизации метилированием и последующим ацетилированием в двух образцах мочи были идентифицированы метаболиты М13.1 и М13.2, имеющие в структуре соединений спиртовую гидроксильную группу в N-алкильном заместителе.

В масс-спектрах метильных производных и артефактов метаболитов MDMB-2201 присутствует молекулярный ион-радикал и ион со 100% интенсивностью, образованный разрывом сигма-связи функциональной группы (амидной или сложноэфирной для М10 – М12) в положении 3. Общим направлением фрагментации, характерным для метиловых эфиров, за исключением метаболитов М10 – М12, является отщепление 2-метилпроп-1-ена, образующегося из трет-бутильного фрагмента с получением ион-радикала [М-56]⁺.

Необходимость проведения гидролиза (ферментативного или щелочного) на предварительной стадии анализа определяется высокой долей конъюгирования маркеров каннабимиметиков; в силу липофильности маркеров их можно выделять, применяя различные гидрофобные сорбенты, либо сорбенты смешанного типа. Последние дают возможность проводить определение маркеров каннабимиметиков в скрининге мочи при поиске наркотических и лекарственных веществ [7].

При использовании на стадии пробоподготовки ТФЭ проведено фракционирование аналитов на фракции кислотного/основного характера. Все выявленные метаболиты MDMB-2201 обнаружены в первом элюате.

При исследовании семи проб мочи потребителей MDMB-2201 исходное соединение обнаружено не было. В анализируемых образцах выявлено 15 метаболитов фазы I биотрансформации MDMB-2201, что свидетельствует об интенсивном метаболизме данного каннабимиметика в организме человека.

В таблице 1 приведены результаты расчета Log P, K_oc (pH=4.8) и оценки относительного содержания, а также степени конъюгации метаболитов MDMB-2201. Из представленных данных видно, что основная доля метаболитов фазы I биотрансформации каннабимиметика элиминируется с мочой в виде конъюгатов, что обусловлено их значительной липофильностью.

Таблица 1. Характеристика каннабимиметика MDMB-2201 и его основных метаболитов (n-количество образцов, где было обнаружено соединение)

Основным направлением метаболизма MDMB-2201 является гидролиз сложноэфирной группы с образованием метаболита М1. Последний может быть использован в качестве маркера употребления MDMB-2201 при скрининговом анализе мочи с применением метода ГХ/МС. Значительное содержание наблюдается так же для N-дезалкильного метаболита М3. Прочие метаболиты определяются в моче в незначительных количествах. Метаболиты MDMB-2201 с сохранением сложноэфирной связи в исследованных образцах мочи не выявлены.

Метаболиты М10 – М12, образующиеся в результате гидролиза амидной группы в положении 3 индольного гетероцикла, идентичны мочевым метаболитам потребителей PB-22F [8].

Метиловые эфиры метаболитов М5, М8, М9, будучи термолабильными, при ГХ/МС исследовании образуют лактоны (артефакты) вследствие процесса внутримолекулярной циклизации.

Заключение

В процессе изучения метаболического профиля с использованием ТФЭ и метода ГХ/МС идентифицированы 15 основных метаболитов и маркеров синтетического каннабимиметика MDMB-2201 в моче его потребителей. Основные направления биотрансформации связаны с гидролизом сложноэфирной группы, реакцией N-дезалкилирования и образованием моногидроксилированных производных, которые выводятся с мочой, преимущественно, в конъюгированном виде. Приведены масс-спектры электронной ионизации идентифицированных метаболитов MDMB-2201, результаты расчетов некоторых физико-химические характеристик и степени конъюгации метаболитов. Полученные данные позволяют использовать их при скрининге биологических объектов на наличие синтетических каннабимиметиков.