Введение

Одними из наиболее часто используемых антиконвульсантов являются производные вальпроевой кислоты. Вальпроаты эффективны в лечении эпилепсии различных форм (большие и малые приступы, миоклоническая, тонико-клоническая и биполярная формы) и других заболеваний ЦНС, сопровождающихся эпилептическим синдромом [5,9]. Они оказывают также противоопухолевое, антиретровирусное, нейропротекторное действие, уменьшают выраженность нейропатической боли. Механизм действия вальпроатов сложен и до конца не изучен. Известно, что вальпроевая кислота повышает концентрацию ГАМК в тканях головного мозга, активируя глутаматдекарбоксилазу (фермент, участвующий в синтезе ГАМК) и угнетая ГАМК-транферазу (фермент, разрушающий ГАМК) [7,8,9]. Вальпроевая кислота может блокировать низковольтажные кальциевые каналы Т-типа аналогично действию этосуксимида, а также потенциалзависимые натриевые каналы по механизму, схожему с фенитоином и карбамазепином [5]. Механизм противоопухолевого действия вальпроевой кислоты связывают с ее способностью угнетать активность гистон-деацетилаз, активирующих пролиферацию клеток и тормозящих их дифференцировку [5,9].

Новым противоэпилептическим средством из группы амидных производных вальпроевой кислоты является вальпразоламид (N-(5-Этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпентанамид). В экспериментах на животных с использованием различных моделей эпилепсии вальпразоламид продемонстрировал высокую противоэпилептическую активность в сочетании с низкой токсичностью [3]. Для выяснения механизма противоэпилептической активности особый интерес представляет экспериментальное исследование его влияния на содержание ГАМК и других нейроактивных аминокислот в головном мозге.

Цель исследования

Целью настоящего исследования явилась исследование влияния вальпразоламида на содержание тормозных и возбуждающих аминокислот в головном мозге крыс.

Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования выполнены с использованием белых аутбредных крыс-самцов Wistar массой 190-210 г. Животных содержали при постоянной температуре (22±2°C) и искусственном 12-часовом режиме дня и ночи (светлое время 08:00-20:00) со свободным доступом к воде и пище. Условия содержания подопытных животных соответствовали правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ [4]. Все эксперименты осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями по проведению доклинических исследований лекарственных средств [2] с соблюдением "Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях" (Directive 2010/63/EU) при наличии разрешения этического комитета Тверского государственного медицинского университета.

Вальпразоламид вводили подопытным крысам внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг (терапевтическая доза для противоэпилептической активности при судорогах, индуцированных пентилентетразолом и максимальным электрошоком). Животные группы контроля получали изотонический раствор натрия хлорида. Декапитацию крыс проводили через 40 мин после введения исследуемого лекарственного средства. Забор крови осуществляли в обработанные натриевой солью гепарина пробирки в объеме 0,5 мл. Головной мозг и его структуры (фронтальную кору и гиппокамп) извлекали на льду, замораживали в жидком азоте и сохраняли в криопробирках при –80°С.

В процессе пробоподготовки головной мозг и его структуры (гиппокамп, фронтальную кору головного мозга) гомогенизировали с метанолом, добавляя в качестве внутреннего стандарта L-норвалин (0,8 мкмоль/мл), используя стеклянный гомогенизатор Поттера. Гомогенизат мозговой ткани центрифугировали при 12000 об/мин. в течение 10 минут при температуре 4^оС. К 500 мкл супернатанта добавляли 500 мкл гексана, пробы встряхивали на вортекс-шейкере в течение 3-х мин и центрифугировали для разделения фаз. Из водной фазы отбирали 100 мкл, добавляли 900 мкл 0,1 н HCl, встряхивали на вортекс-шейкере, после чего к 100 мкл полученного экстракта добавляли 900 мкл 0,1 н HCl и встряхивали на вортекс-шейкере. Полученные гомогенаты мозговой ткани использовали для биохимических исследований.

Количественное определение содержания вальпразоламида [1], тормозных (γ-аминомасляной кислоты, глицина) и возбуждающих (глутаминовой и аспарагиновой кислот и их амидов) аминокислот в гомогенатах головного мозга крыс осуществляли хромато-масс-спектрометрическим методом (ВЭЖХ-МС/МС). Методика была валидирована по параметрам селективности, точности, прецизионности, линейности, стабильности (EMA 2010).

Хроматографический анализ биологических образцов осуществляли с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа Agilent 1260 Infinity II (Agilent Technologies, ФРГ) с аналитической колонкой Eclipse ААA 3,5 мкм 3×150 мм при температуре 40^оС. Хроматографию проводили в градиентном режиме: 0-2 мин – смесь ацетонитрила и воды деионизированной в соотношении 5:95 с добавлением 0,1% муравьиной кислоты; 2-6 мин – увеличение концентрации ацетонитрила до 70%, 6-7 мин – фаза плато (70% ацетонитрил), 7-10 мин – ацетонитрил и вода деионизированная в соотношении 5:95. Скорость потока подвижной фазы – 0,4 мл/мин; объем вводимой пробы – 5 мкл; общее время градиентного элюирования – 10 минут.

Определение аминокислот в биологических образцах осуществляли без предшествующей дериватизации. Детекцию нейроаминокислот осуществляли масс-спектрометрически. В качестве детектора использовали тройной квадрупольный масс-спектрометр AB Sciex QTrap 3200 MD (AB Sciex, Сингапур) с электрораспылительным источником ионов (Turbo V с зондом TurboIonSpray).

Результаты исследований обрабатывали статистически с применением программного обеспечения "AnalystSoft Inc., BioStat – программа статистического анализа. Версия 2009". Анализ вида распределения количественных признаков и проверку равенства дисперсий проводили с использованием критерия Шапиро-Уилка. Для оценки достоверности различий выборок, имеющих нормальное распределение, применяли параметрический t-критерий Стьюдента, в случае ненормального распределения использовали U-тест Манна-Уитни. За достоверное принимали различие при уровне вероятности 95% и более (p<0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

На начальном этапе экспериментального исследования подбирали оптимальные параметры для хромато-масс-спектрометрического определения тормозных (γ-аминомасляной кислоты и глицина) и возбуждающих (глутаминовой и аспарагиновой кислот и их амидов) аминокислот в гомогенатах головного мозга крыс. Для каждого аналита определяли время удерживания для используемого режима градиентного элюирования. На рисунках 1-3 показаны нейроаминокислоты на хроматограммах гомогенатов головного мозга крыс.

Рис. 1. γ-Аминомасляная кислота (А) и глицин (Б) на хроматограмме гомогената головного мозга крыс.

Рис. 2. L-аспарагин (А) и L-аспарагиновая кислота (Б) на хроматограмме гомогената головного мозга крыс.

Рис. 3. L-глутамин (А) и L-глутаминовая кислота (Б) на хроматограмме гомогената головного мозга крыс.

Детекцию аминокислот осуществляли масс-спектрометрически. Для каждого аналита подбирали оптимальное значение энергии столкновения. Идентификацию глицина осуществляли при положительной ионизации ([M+H]⁺) в режиме селективного ионного мониторинга (SIM) по значению m/z 76. Для масс-спектрометрической идентификации остальных аминокислот использовали режим мониторинга множественных реакций (MRM) при положительной ионизации. Значения MRM составили для γ-аминомасляной кислоты, L-аспарагиновой кислоты, L-аспарагина, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина соответственно m/z 104 →m/z 87 и m/z 45; m/z 134,1 →m/z 74; m/z 133,1→m/z 74,1; m/z 148,1 →m/z 84; m/z147,1→m/z 84,1. Хромато-масс-спектрометрические параметры нейроаминокислот приведены в таблице 1.

Таблица 1. Хромато-масс спектрометрические параметры нейроактивных аминокислот

Нижние пределы идентификации и количественного определения нейроактивных аминокислот определяли по соотношению сигнал/шум соответственно 1:3 и 1:10 (табл. 2).

Таблица 2. Нижние пределы идентификации и количественного определения нейроактивных аминокислот в гомогенатах головного мозга крыс хромато-масс-спектрометрическим методом

Диапазоны линейности, уравнения регрессии и значения коэффициента корреляции для хромато-масс-спектрометрического метода определения γ-аминомасляной кислоты, глицина, глутаминовой и аспарагиновой кислот и их амидов в гомогенатах головного мозга крыс приведены в таблице 3.

Таблица 3. Уравнение регрессии, коэффициент корреляции и линейный диапазон при хромато-масс-спектрометрическом определении нейроактивных аминокислот в головном мозге крыс

Анализ результатов проведенного экспериментального исследования показал, что вальпразоламид, обладая высокой липофильностью, хорошо проникает через гематоэнцефалический барьер. Через 40 минут после внутрибрюшинного введения в дозе 100 мг/кг его содержание в головном мозге подопытных крыс составило 1167,6±39,4 мкг/г, а концентрация в плазме крови – 242,0±29,1 мкг/мл. Одновременно в головном мозге подопытных крыс, получавших вальпразоламид, было выявлено изменение содержания нейроактивных аминокислот по сравнения с их уровнем у животных группы контроля, получавших изотонический раствор натрия хлорида. Наиболее существенные изменения уровня нейроаминокислот были выявлены в гиппокампе и во фронтальной коре подопытных животных (табл. 4).

Таблица 4. Содержание аминокислот (Мean±S.E.M.) в гиппокампе и фронтальной коре головного мозга крыс при внутрибрюшинном введении вальпразоламида (100 мг/кг)

Отмечено, что у интактных животных содержание ГАМК в гиппокампе было в среднем на 22,7% выше (р<0,05), чем во фронтальной коре. В серии опытов с введением вальпразоламида (100 мг/кг) было обнаружено увеличение уровня этой аминокислоты в головном мозге, преимущественно во фронтальной коре в среднем на 11% (р<0,05). Достоверных изменений содержания глицина под влиянием вальпразоламида отмечено не было. Уровень глутаминовой кислоты снизился в среднем на 12,2% во фронтальной коре, в гиппокампе отмечена лишь тенденция к снижению уровня данной аминокислоты. Обращает на себя внимание тот факт, что содержание глутамина (амидной формы глутаминовой кислоты, которая образуется в глиальных клетках после захвата глутаминовой кислоты из синаптической щели) под влиянием вальпразоламида напротив увеличилось соответственно на 15,9% (р<0,05) и 14,2% (р<0,05) в гиппокампе и во фронтальной коре. Одновременно обнаружено снижение уровня аспарагиновой кислоты во фронтальной коре в среднем на 16,5% (р<0,05) и ее амидной формы в среднем в 2 раза (р<0,05) во фронтальной коре и гиппокампе.

Выводы

Таким образом, вальпразоламид – новое противоэпилептическое средство из группы амидных производных вальпроевой кислоты, являясь липофильным соединением, хорошо проникает через гематоэнцефалический барьер и вызывает выраженные изменения содержания нейроактивных аминокислот. При однократном внутрибрюшинном введении интактным крысам в дозе 100 мг/кг отмечалось характерное для вальпроатов увеличение уровня ГАМК во фронтальной коре головного мозга, снижение уровня возбуждающих нейроаминокислот – аспарагиновой и глутаминовой кислот во фронтальной коре и увеличение уровня амидной формы глутаминовой кислоты в гиппокампе и во фронтальной коре.